本实验教程由两大部分十大实验组成，包括质粒提取、核酸回收、载体连接、

PCR 进行克隆鉴定、SDS-PAGE 以及Western blot 等。在系统进行一个基因克隆的同时让学生全面掌握质粒、限制性内切酶、连接酶、感受态、转化PCR 、重组蛋白表达及鉴定等基本操作；从而使学生巩固基因工程学理论知识，并为将来进一步学习打下技术基础。

分子生物学与基因工程技术在现代生命科学的发展中起着至关重要的作用，因此分子生物学与基因工程是生命科学领域十分重要的专业基础课。目前，对应的理论课教材选择面大、体系成熟，而适合学生使用的有针对性的实验课教材比较缺乏，编者结合自己的教学经验，编写了《分子生物学与基因工程实验教程》。

本实验教程是针对各类综合院校的生物技术专业编写，紧扣分子生物学与基因工程学理论课教学内容，设计实验前后连贯，每个实验在6 节课内完成，集中时间完成整个课程共10 个大的实验，内容涉及质粒提取、限制性内切酶酶切、核酸片段回收、连接酶连接、感受态细胞制备、质粒转化、克隆鉴定、真核表达、SDS-PAGE 电泳分离蛋白以及最后的Western blot 进行靶蛋白的鉴定。各个实验能从时间上分隔开，但前后又是一个连续的整体来完成一个从基因克隆到蛋白表达、鉴定的完整过程。

由于编写时间较紧、编写经验不足等，难免存在疏漏之处，敬请读者见谅。

本教材的编写得到同济大学生命科学与技术学院、教务处以及实验教学中心老师的大力支持，同时也得到了吴宏强博士的大力协助，在此一并致谢！

杜昌升　

2013 年5 月

第１部分　基因工程实验

实验1　重组质粒pcDNA3.0-ARRB 的提取，质量检测及酶切分析……3 

1.1 

　质粒提取……………………………………………………………… 4 

1.2 

　质粒质量检测………………………………………………………… 6 

1.3 

　质粒酶切……………………………………………………………… 7 

1.4 

　琼脂糖凝胶电泳检测………………………………………………… 7 

实验2　用琼脂糖凝胶电泳进行目的DNA 片段的回收及质量检测……11 

1.1 

　用琼脂糖凝胶电泳进行目的DNA 片段的分离…………………11 

1.2 

　从凝胶中回收目的DNA 片段……………………………………13 

1.3 

　DNA 片段浓度及纯度检测…………………………………………15 

实验3　目的DNA 片段与载体连接，感受态制备及连接产物的转化……17 

1.1 

　连接反应……………………………………………………………18 

1.2 

　感受态制备…………………………………………………………18 

1.3 

　连接产物转化感受态细菌…………………………………………19 

实验4　PCR鉴定细菌克隆………………………………………………23 

1.1 

　PCR 鉴定克隆………………………………………………………24 

1.2 

　琼脂糖凝胶电泳……………………………………………………26 

实验5　SDS-PAGE 电泳及考马斯亮蓝染色分析目的蛋白的表达……27 

1.1 

　电泳胶的制备………………………………………………………29 

1.2 

　蛋白样品制备及SDS-PAGE 电泳…………………………………30 

1.3 

　转膜…………………………………………………………………30 

1.4 

　考马斯亮蓝染色……………………………………………………31 

实验6　Western blot 分析目的蛋白的表达……………………………32 

1.1 

　SDS-PAGE 电泳……………………………………………………32 

1.2 

　转膜…………………………………………………………………32 

1.3 

　封闭…………………………………………………………………33 

1.4 

　一抗孵育……………………………………………………………33 

1.5 

　二抗孵育……………………………………………………………33 

1.6 

　显色…………………………………………………………………34 

第2 部分　分子生物学实验

实验7　大肠杆菌基因组DNA 的提取与定量…………………………37 

实验8　大肠杆菌生物素连接酶基因的RCR 扩增及扩增产物的鉴定……43 

实验9　小鼠肝组织中总RNA 的提取…………………………………45 

实验10　逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） …………………………47 

附录材料………………………………………………………………………50 

·VI·